|
|
Functional analysis of posttranscriptional gene regulation by TENT5A in biomineralization and metabolism
Aranaz Novaliches, Goretti ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Hovořáková, Mária (oponent) ; Tencerová, Michaela (oponent)
Nekanonické poly-A polymerázy, jako je TENT5A, patří do rodiny terminálních nukleotidyltransferáz (TENT) a mají zásadní význam pro ochranu, stabilitu a translaci mRNA. V naší laboratoři byl vytvořen knock-out (KO) model myši Tent5a, který vykazoval fenotyp v oblasti zubů, struktury kostry a metabolismu. Ve svém doktorském projektu jsem se zaměřila na charakterizaci molekulárního mechanismu, který je základem těchto fenotypů, a na zkoumání jejich potenciální souvislosti se vzácnými lidskými chorobami. Zaměřila jsem se na biologickou funkci genu Tent5a při vývoji skloviny (amelogenezi) a stabilizaci mRNA. Mikrotomografie (μCT) a skenovací elektronová mikroskopie odhalily, že Tent5a KO jedinci vykazují tenkou hypomineralizovanou sklovinu s narušenou mikrostrukturou, což je stav známý jako Amelogenesis imperfecta. Přímé sekvenování mRNA prokázalo, že TENT5A je zodpovědný za polyadenylaci amelogeninu (AmelX) a dalších vylučovaných proteinů, což vede ke zkrácení poly-A konce u ameloblastů Tent5a KO myší. U Tent5a KO jedinců byla navíc zjištěna porucha samo sestavování proteinů sklovinné matrix (EMP), jako je AMELX a ameloblastin (AMBN), což vedlo ke zhoršenému ukládání hydroxyapatitu a ovlivnění tvorby skloviny. Kromě úlohy v zubech jsem zkoumala fyziologické funkce EMP v jiných tkáních vzhledem k tomu,...
|
|
|
CX3CR1+ migratory dendritic cells in the mechanisms of central tolerance
Březina, Jiří ; Filipp, Dominik (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Produkce mnoha tělu vlastních antigenů v thymu je zcela nezbytná pro ustanovení centrální tolerance, neboť její selhání může vést k rozvoji autoimunity. Tyto antigeny jsou prezentovány vyvíjejícím se T lymfocytům medulárními epiteliálními buňkami (mTECs) a dendritickými buňkami (DCs), které tvoří hlavní populace antigen-prezentujících buněk (APCs) v thymu. Zatímco mTECs prezentují antigeny, které samy produkují, DCs získávají tyto antigeny od mTECs procesem kooperativního antigenního transferu (CAT). Přestože zásadní funkce CAT v mechanismech centrální tolerance je známá, celková heterogenita APC buněk v thymu účastnících se tohoto procesu je nejasná. Díky využití transgenních myších modelů a pokročilé průtokové cytometrie jsme objevili, že APCs, které získávají antigeny od mTECs, jsou striktně CD11c pozitivní. V rámci populace DCs v thymu jsme identifikovali dříve nerozpoznanou CX3CR1+ subpopulaci migratorních DCs (mDCs), která se vyznačuje expresí molekulárních markerů monocytů a makrofágů. Tyto CX3CR1+ mDCs jsou více efektivní v získávání antigenů procesem CAT než CX3CR1- populace a díky velice dobrým antigen-prezentujícím schopnostem dokáží tyto antigeny prezentovat T lymfocytům. Genetické odstranění CX3CR1+ mDCs vedlo ke zvýšení počtu CD8+ a CD4+ thymocytů, což naznačuje, že tyto buňky hrají...
|
|
|
Metodika přípravy transgenní myši.
Reslová, Gabriela ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Pěknicová, Jana (oponent)
Souhrn Práce se zabývá problematikou přípravy transgenních myší a srovnáním jednotlivých metodologických postupů z hlediska efektivity a vhodnosti aplikace pro výzkumné účely. Techniky pro přenos genových konstruktů zahrnují preferovanou mikroinjekci DNA do pronuklea oplodněného vajíčka. Jakož i možnosti spojené s využitím spermií, jež přenášejí zabudovaný genový konstrukt do oocytu při in vitro oplození, nebo za využití retrovirových vektorů, kterými jsou oocyty infikovány. Přenos jader somatických buněk do enukleovaných oocytů, využití embryonálních kmenových buněk, které jsou vnášeny do cizích zárodků či transgeneze pomocí liposomů jsou techniky prozatím používané okrajově z důvodu nutnosti hlubšího probádání. V další části seznamuje práce čtenáře s jednotlivými kroky, jež je nutné provést pro úspěšnost transgeneze. Předmětem zájmu je zde ovariální stimulace nutná pro získání dostatečného množství oocytů, ale také jako příprava pro embryo transfer, jakož i kapacitace spermií, která je zásadní pro in vitro oplození. Práce se rovněž zabývá zpětnou analýzou potvrzení pozitivity exprese transgenu pomocí genotypizace potomků a křížením pozitivních transgenů a srovnává výhody a nevýhody získání homozygotní transgenní linie. Klíčová slova: Transgenní myš, perinukleární injekce, ovariální stimulace, kapacitace,...
|
|
|
Function of Zinc finger protein 644 (Zfp644) in mouse organism.
Szczerkowska, Katarzyna Izabela ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Komrsková, Kateřina (oponent) ; Blahoš, Jaroslav (oponent)
Gen ZNF644 kóduje transkripční regulátor Zinc Finger Protein 644 patřící do podrodiny Cys2-His2 zinc finger proteinů. Mutace lidskeho ZFN644 (S672G) způsobuje vážnou dědičnou myopii. Výzkum ukázal, že ZFN644 ovlivnujě expresi podřízených genů prostřednictvím interakce s komplexem G9a/GLP (G9a - euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2, EHMT2; GLP - euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1, EHMT1), který hraje významnou roli při methylaci histonů, konkrétně H3Kme1 a H3K9me2. Dále tento komplex může vázat transkripční factor WIZ (Widely-Interspaced Zinc Finger-Containing Protein) a tím současně regulovat umlčení jemu podřízených genů. Abychom mohli studovat dopad mutace ZFP644 na vývoj myopie, vytvořili jsme myší modely, jeden mimikující lidskou mutaci - Zfp644S673G a druhý se zkrácenou formou proteinu Zfp644Δ8 . Oba modely byly podrobeny důkladné vyšetření funkce a morfologie retiny. S využitím ultrasonografie, byly u těchto modelů odhaleny fenotypy v podobě poruchy retiny. Měření potvrdilo spojitost mutace Zfp644 a myopie v obou modelech, navíc byly odhaleny vážné poruchy metabolismu a fertility samic u Zfp644Δ8 modelu. Pro detailnější popis vlivu Zfp644 na plodnost byly provedeny experimenty zahrnujicí analýzu exprese Zfp644 v reprodukčních orgánech, morfometrie vaječníků,...
|
|
|
CX3CR1+ migratory dendritic cells in the mechanisms of central tolerance
Březina, Jiří ; Filipp, Dominik (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Produkce mnoha tělu vlastních antigenů v thymu je zcela nezbytná pro ustanovení centrální tolerance, neboť její selhání může vést k rozvoji autoimunity. Tyto antigeny jsou prezentovány vyvíjejícím se T lymfocytům medulárními epiteliálními buňkami (mTECs) a dendritickými buňkami (DCs), které tvoří hlavní populace antigen-prezentujících buněk (APCs) v thymu. Zatímco mTECs prezentují antigeny, které samy produkují, DCs získávají tyto antigeny od mTECs procesem kooperativního antigenního transferu (CAT). Přestože zásadní funkce CAT v mechanismech centrální tolerance je známá, celková heterogenita APC buněk v thymu účastnících se tohoto procesu je nejasná. Díky využití transgenních myších modelů a pokročilé průtokové cytometrie jsme objevili, že APCs, které získávají antigeny od mTECs, jsou striktně CD11c pozitivní. V rámci populace DCs v thymu jsme identifikovali dříve nerozpoznanou CX3CR1+ subpopulaci migratorních DCs (mDCs), která se vyznačuje expresí molekulárních markerů monocytů a makrofágů. Tyto CX3CR1+ mDCs jsou více efektivní v získávání antigenů procesem CAT než CX3CR1- populace a díky velice dobrým antigen-prezentujícím schopnostem dokáží tyto antigeny prezentovat T lymfocytům. Genetické odstranění CX3CR1+ mDCs vedlo ke zvýšení počtu CD8+ a CD4+ thymocytů, což naznačuje, že tyto buňky hrají...
|
|
|
Metodika přípravy transgenní myši.
Reslová, Gabriela ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Pěknicová, Jana (oponent)
Souhrn Práce se zabývá problematikou přípravy transgenních myší a srovnáním jednotlivých metodologických postupů z hlediska efektivity a vhodnosti aplikace pro výzkumné účely. Techniky pro přenos genových konstruktů zahrnují preferovanou mikroinjekci DNA do pronuklea oplodněného vajíčka. Jakož i možnosti spojené s využitím spermií, jež přenášejí zabudovaný genový konstrukt do oocytu při in vitro oplození, nebo za využití retrovirových vektorů, kterými jsou oocyty infikovány. Přenos jader somatických buněk do enukleovaných oocytů, využití embryonálních kmenových buněk, které jsou vnášeny do cizích zárodků či transgeneze pomocí liposomů jsou techniky prozatím používané okrajově z důvodu nutnosti hlubšího probádání. V další části seznamuje práce čtenáře s jednotlivými kroky, jež je nutné provést pro úspěšnost transgeneze. Předmětem zájmu je zde ovariální stimulace nutná pro získání dostatečného množství oocytů, ale také jako příprava pro embryo transfer, jakož i kapacitace spermií, která je zásadní pro in vitro oplození. Práce se rovněž zabývá zpětnou analýzou potvrzení pozitivity exprese transgenu pomocí genotypizace potomků a křížením pozitivních transgenů a srovnává výhody a nevýhody získání homozygotní transgenní linie. Klíčová slova: Transgenní myš, perinukleární injekce, ovariální stimulace, kapacitace,...
|
|
|
Characterization of the role of SPINK 6 in the epidermis using transgenic models
Buryová, Halka ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Epidermis tvoří bariéru mezi vnitřním a vnějším prostředím, přičemž celková homeostáze je závislá mezi jiným i na správné obměně keratinocytů. Podstatnou úlohu hrají v tomto procesu serinové proteázy a jejich inhibitory. Aktivované proteázy štěpí desmosomy ve svrchní vrstvě epidermis a umožňují tak odlupování keratinocytů. V nižších vrstvách epidermis jsou proto vylučovány proteázové inhibitory, jejichž funkcí je zabránit předčasné aktivaci proteáz, a tím rozrušení epidermální bariéry. Mezi nejznámější inhibitory v epidermis patří inhibitory serinových proteáz kazálního typu (SPINK). Tato práce je orientována na výzkum myšího SPINK6 in vivo. K tomu účelu jsme pomocí modifikovaného lidského involukrinového promotoru vytvořili transgenní myši exprimující mSPINK6 ve zvýšené míře, přičemž vyšší expresi mSPINK6 na mRNA a proteinové úrovni RNA vykazovaly dvě z pěti trasngenních linií. Ukázali jsme, že transgenní zvířata jsou životaschopní jedinci bez zjevného fenotypového projevu. Na makroskopické úrovni jsme pak popsali mírný fenotyp, který odlišuje transgenní mSPINK6 myši od normálních jedinců. Závěrem lze říci, že mSPINK6 hraje v homeostázi kůže nejspíš pouze minoritní roli, naproti tomu však může být velmi důležitý při specifické obměně epidermální bariéry. Námi připravené mSPINK6 trasngenní myši mohou být...
|
host ::
RSS.